Inhalt
Die Polymerase-Kettenreaktion oder PCR ist eine Technik, die ein DNA-Fragment in viele Fragmente fotokopiert - exponentiell viele. Der erste Schritt bei der PCR besteht darin, die DNA so zu erhitzen, dass sie denaturiert oder zu Einzelsträngen schmilzt. Die Struktur der DNA ist wie eine Strickleiter, in der die Sprossen Seile mit magnetischen Enden sind. Die Magnete verbinden sich zu den Sprossen, den so genannten Basispaaren, und können nicht auseinandergezogen werden. Jedes DNA-Fragment schmilzt bei unterschiedlichen Temperaturen zu Einzelsträngen. Wenn Sie verstehen, wie die Struktur der DNA durch die einzelnen Teile der DNA zusammengehalten wird, können Sie nachvollziehen, warum verschiedene DNA-Fragmente bei unterschiedlichen Temperaturen schmelzen und warum diese hohen Temperaturen überhaupt erforderlich sind.
Schmelzen! Schmelzen!
Der erste Schritt der PCR besteht darin, die DNA zu schmelzen, so dass doppelsträngige DNA in einzelsträngige DNA zerfällt. Für Säugetier-DNA beinhaltet dieser erste Schritt normalerweise eine Wärme von ungefähr 95 Grad Celsius (ungefähr 200 Fahrenheit). Bei dieser Temperatur brechen die Wasserstoffbrücken zwischen den A-T- und G-C-Basenpaaren oder den Sprossen in der DNA-Leiter auseinander und öffnen die doppelsträngige DNA. Die Temperatur ist jedoch nicht heiß genug, um das Phosphat-Zucker-Rückgrat, das die einzelnen Stränge bildet, oder die Pole der Leiter zu brechen. Die vollständige Trennung der Einzelstränge bereitet sie auf den zweiten Schritt der PCR vor, bei dem gekühlt wird, damit kurze DNA-Fragmente, sogenannte Primer, die Einzelstränge binden können.
Magnetische Reißverschlüsse
Ein Grund, warum DNA auf die hohe Temperatur von 95 Grad Celsius erhitzt wird, ist, dass je länger der DNA-Doppelstrang ist, desto mehr möchte er zusammen bleiben. Die DNA-Länge ist ein Faktor, der den für die PCR auf diesem DNA-Stück gewählten Schmelzpunkt beeinflusst. Die A-T- und G-C-Basenpaare in der doppelsträngigen DNA verbinden sich miteinander, um die Doppelstrangstruktur zusammenzuhalten. Je mehr aufeinanderfolgende Basenpaare zwischen zwei Einzelsträngen verbunden sind, desto mehr möchten sich auch ihre Nachbarn verbinden, und desto stärker wird die Anziehungskraft zwischen den beiden Strängen. Es ist wie ein Reißverschluss aus kleinen Magneten. Wenn Sie den Reißverschluss schließen, möchten die Magnete natürlich einen Reißverschluss öffnen und bleiben.
Stärkere Magnete haften fester
Ein weiterer Faktor, der die Schmelztemperatur für Ihr DNA-Fragment von Interesse beeinflusst, ist die Menge der in diesem Fragment vorhandenen G-C-Basenpaare. Jedes Basenpaar ist wie zwei Mini-Magnete, die sich anziehen. Ein Paar aus G und C wird viel stärker angezogen als ein A- und T-Paar. Ein DNA-Stück mit mehr G-C-Paaren als ein anderes Fragment erfordert daher eine höhere Temperatur, bevor es zu Einzelsträngen verschmilzt. DNA absorbiert natürlicherweise ultraviolettes Licht - genauer gesagt bei einer Wellenlänge von 260 Nanometern - und einzelsträngige DNA absorbiert mehr Licht als doppelsträngige DNA. Die Messung der absorbierten Lichtmenge ist also eine Methode, um zu messen, wie viel Ihre doppelsträngige DNA zu Einzelsträngen geschmolzen ist. Der "magnetische Reißverschluss" -Effekt von G-C- und A-T-Basenpaaren bewirkt, dass ein Diagramm der Lichtabsorption von doppelsträngiger DNA, aufgetragen gegen einen Temperaturanstieg, sigmoidal, wie ein S geformt und keine gerade Linie ist. Die Kurve des S repräsentiert den Teamwork-Widerstand, den die Basenpaare gegen die Hitze ausüben, weil sie sich nicht trennen wollen.
Der halbe Weg
Die Temperatur, bei der eine DNA-Länge zu Einzelsträngen schmilzt, wird als Schmelztemperatur bezeichnet, die mit der Abkürzung „Tm“ bezeichnet wird. Dies gibt die Temperatur an, bei der die Hälfte der DNA in einer Lösung zu Einzelsträngen geschmolzen ist und die andere Hälfte noch in doppelsträngiger Form. Die Schmelztemperatur ist für jedes DNA-Fragment unterschiedlich. Säugetier-DNA hat einen G-C-Gehalt von 40%, was bedeutet, dass die verbleibenden 60% der Basenpaare As und Ts sind. Sein 40% iger G-C-Gehalt bewirkt, dass Säugetier-DNA bei 87 Grad Celsius (etwa 189 Fahrenheit) schmilzt. Aus diesem Grund besteht der erste Schritt der PCR auf Säugetier-DNA darin, sie auf 94 Grad Celsius (201 Fahrenheit) zu erwärmen. Nur sieben Grad heißer als die Schmelztemperatur und alle Doppelstränge schmelzen vollständig zu Einzelsträngen.