Inhalt
- Serienverdünnungen
- Vorbereitung der Platten zur Berechnung des Titers
- Zählung und Berechnung des Virustiters
- Warnungen
Die Berechnung des Titers für ein Virus ist ein komplizierter Ausdruck dafür, dass ein Wissenschaftler die Anzahl der Viren in einer bestimmten Probe zählt. Um die Virustiter zu berechnen, infizieren Wissenschaftler Platten mit wachsenden Bakterien mit Viruslösungen in unterschiedlichen Konzentrationen und ermitteln die Anzahl der Viren in der ursprünglichen Lösung, indem sie die Bakterien zählen, die aufgrund der Virusinfektion gestorben sind.
Serienverdünnungen
Ziehen Sie Handschuhe an, füllen Sie 10 Kulturröhrchen mit 9 ml Brühe und beschriften Sie diese mit „10 ^ -1“, „10 ^ -2“, „10 ^ -3“ usw. bis „10 ^ -10“. Diese Röhrchen wird für virale Verdünnungsreihen verwendet, die zur Berechnung des Phagentiters verwendet werden. Da Viren zu unglaublich hohen Konzentrationen heranwachsen können, müssen Sie sie verdünnen, um sie effektiv zählen zu können. Jedes Röhrchen repräsentiert eine zehnfache Verdünnung des Virus.
Nehmen Sie 1 ml der Viruskultur, für die Sie den Phagentiter berechnen möchten, und übertragen Sie sie mit einer Pipette in das Röhrchen mit dem Titel „10 ^ -1“. Röhrchen gut mischen. Dies ist Ihre erste zehnfache Verdünnung.
Nehmen Sie 1 ml der Mischkultur aus Ihrem Röhrchen mit der Bezeichnung „10 ^ -1“ und übertragen Sie sie mit einer neuen Pipette in das nächste Röhrchen mit der Bezeichnung „10 ^ -2“. Mischen Sie auch dieses Röhrchen.
Setzen Sie dieses Muster fort, um eine serielle Verdünnungsreihe zu erstellen. Sie erhalten 9 Röhrchen mit 9 ml und 1 Röhrchen mit 10 ml. Die Viruslast in Ihren Röhrchen wird zwischen dem 10-fachen (Ihre erste Röhre) oder dem 100-fachen (Ihre zweite Röhre) und dem 10-fachen (Ihre letzte Röhre) verdünnt.
Vorbereitung der Platten zur Berechnung des Titers
Nehmen Sie 10 Röhrchen Trypton-Weichagar und 10 Petrischalen und beschriften Sie diese entsprechend Ihren Serienverdünnungsröhrchen.
Lösen Sie die Kappen, damit sie nicht in der Hitze herausspringen, und stellen Sie die Agarrohre in einen Becher mit kochendem Wasser. Dadurch wird der Agar geschmolzen, sodass Sie ihn in Petrischalen gießen können.
Übertragen Sie Ihre Röhren in ein Heißwasserbad mit einer Mindesttemperatur von 45 Grad Celsius. Dadurch wird sichergestellt, dass sich Ihr Agar nicht in den Röhrchen verfestigt, bevor Sie die Möglichkeit haben, ihn in eine Petrischale zu gießen.
Fügen Sie Ihrem Agar zwei Tropfen Bakterienkultur hinzu und mischen Sie sie vorsichtig. Dies sind die Bakterien, die abgetötet werden, sodass Sie die Anzahl der Viruspartikel in einer bestimmten Lösung zählen können.
1 ml jeder Verdünnungsreihe in das entsprechende Agarröhrchen geben, während sich die Röhrchen noch im Heißwasserbad befinden. Zum Beispiel sollte 1 ml Ihrer 10 ^ -1-Serienverdünnung in das Agarröhrchen mit der Bezeichnung "10 ^ -1" gegeben werden.
Mischen Sie jedes Röhrchen und gießen Sie jedes Röhrchen mit dem entsprechenden Etikett in die Petrischale. Dadurch entsteht eine dünne Agarschicht, die auf jeder Platte mit Bakterien und Viren beimpft wurde. Lassen Sie die Platten über Nacht in einem Inkubator wachsen.
Zählung und Berechnung des Virustiters
Nehmen Sie Ihre Teller aus dem Inkubator und untersuchen Sie sie. Sie sollten überall auf der Platte trübe Stellen sehen, an denen Bakterien gewachsen sind, mit Ausnahme kleiner klarer Stellen, die Plaques genannt werden. Diese Plaques sind Flecken von toten Bakterien, und jede Plaque repräsentiert ein Virus.
Suchen Sie eine Platte mit 30 bis 300 Plaques und zählen Sie die genaue Anzahl der Plaques auf dieser Platte.
Nehmen Sie die Anzahl der Plaques auf Ihren Teller und multiplizieren Sie sie mit 10. Wenn Sie 157 Plaques gezählt haben, erhalten Sie 1570.
Multiplizieren Sie die Zahl, die Sie im vorherigen Schritt erhalten haben, mit der Umkehrung der Zahl auf Ihrem Verdünnungsröhrchen. Wenn die von Ihnen ausgewählte Platte beispielsweise die 10 ^ -5-Platte war, würden Sie 1570 mit 10 ^ 5 multiplizieren, um 157000000 zu erhalten. Diese endgültige Zahl ist Ihr Phagentiter und repräsentiert die Anzahl der Viren pro ml Ihrer ursprünglichen Kultur.