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Das genetische Blau einer Zelle ist in ihrem genetischen Material, der DNA, kodiert. Da die DNA niemals den Zellkern verlässt, ist es erforderlich, die DNA zunächst in Messenger-RNA (mRNA oder Poly (A) -RNA) zu transkribieren, damit diese Informationen in das Zytoplasma gelangen, in dem sich andere Proteine und biochemische Komponenten befinden. Diese mRNA wird dann in Proteine übersetzt, die viele Funktionen der Zelle erfüllen. Um sehr seltene mRNAs zu detektieren oder zu quantifizieren, Sonden für Microarrays herzustellen oder Bibliotheken komplementärer DNA-Moleküle zu konstruieren, muss mRNA isoliert werden. Die Gesamt-RNA-Extraktion (d. H. Die gesamte RNA in einer Zelle) und die anschließende mRNA-Isolierung schließen sich jedoch nicht gegenseitig aus. Ersteres muss durchgeführt werden, damit die mRNA extrahiert werden kann.
Isolierung von mRNA aus Gesamt-RNA
TRIzol-Homogenisierung: Die Gesamt-RNA umfasst alle mRNAs, Transfer-RNAs, ribosomalen RNAs und andere nichtkodierende RNAs. Um diese von anderen zellulären Komponenten zu trennen, wird die Zelle zuerst aufgebrochen, um ihren Inhalt freizugeben. Dies erfolgt durch Resuspendieren von Zellen, die durch Zentrifugieren (Schleudern mit hoher Geschwindigkeit) in TRIzol Reagent (Life Technologies) pelletiert wurden. Andere Versionen von TRIzol (wie das TRI-Reagenz von Ambion) funktionieren ähnlich.
Gesamt-RNA-Isolierung: Eine Reihe von Zentrifugationen wird verwendet, um die verschiedenen Bestandteile (Proteine, DNA, RNA) der Zelle in Schichten oder Phasen innerhalb der Suspension zu trennen. Die obere, gelb gefärbte Phase besteht aus Fett und kann verworfen werden. Die gewünschte Phase ist rot getönt, enthält die gesamte RNA und bleibt erhalten. Nach einer Phenol-Chloroform-Extraktion und einer Reihe von Alkoholwäschen mit Isopropanol und Ethanol kann die RNA zur mRNA-Isolierung pelletiert werden. Fügen Sie RNase-Inhibitoren hinzu, um zu verhindern, dass dieses Enzym die gesamte RNA abbaut.
mRNA-Extraktion: Es ist üblich, ein Kit zur Isolierung von mRNAs zu verwenden, da hausgemachte Laborprotokolle keine großen Mengen hochreiner mRNAs erzeugen. Kommerzielle Kits umfassen Invitrogens FastTrack 2.0 oder Ambions Poly (A) Pure mRNA Isolation Kit. Diese grundlegenden Schritte sind solchen Kits gemeinsam:
a) Mischen Sie den im Kit enthaltenen RNase-inhibierten Lysepuffer mit bis zu 300 Mikrolitern Gesamt-RNA.
b) 5 Minuten auf 65 Grad Celsius erhitzen und dann die Probe sofort eine Minute auf Eis abkühlen lassen.
c) Mische dies mit 0,5 M Natriumchlorid und löse dann Oligo dT (Oligodesoxythymidylsäure) vollständig in dieser Probe.
d) Zentrifugieren Sie diese Probe und gewinnen Sie den Überstand, der mehrmals in einer Reihe von Bindungs- und Niedrigsalzpuffern gewaschen wird, die in den Kits enthalten sind.
e) mRNA mehrmals eluieren, bis ein vom Kit vorgegebenes Volumen (z. B. 500 Mikroliter) erhalten wird.
f) Fällung des Eluats durch Fällung mit Natriumacetat und Ethanol. In bis zu 20 Mikrolitern Diethylpyrocarbonat (DEPC) -behandeltem Wasser resuspendieren.
g) Bei -80 Grad Celsius lagern und spektrophotometrisch auf Qualität und Quantität prüfen.