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Bei der Arbeit mit Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC) ist eine gute Kalibrierung unbedingt erforderlich, um zuverlässige und qualitativ hochwertige Ergebnisse zu erzielen. Die ordnungsgemäße Kalibrierung eines HPLC-Instruments beginnt mit der Erstellung eines geeigneten Kalibrierungsstandards. In den meisten Fällen erfordert die Kalibrierung tatsächlich eine Reihe von Standards mit zunehmender Konzentration, um eine sogenannte Kalibrierungskurve zu erstellen. Dies ist eine geplottete Linie und die zugehörige Gleichung, die die Beziehung zwischen der Konzentration der Chemikalie, auf die getestet wird, und der Reaktion des HPLC-Detektors beschreibt.
Bestimmen Sie die zu testende Chemikalie mit der HPLC (der "Analyt"). Beispielsweise möchten Sie möglicherweise eine Reihe von Erfrischungsgetränken auf ihren Fructosegehalt testen. In diesem Fall ist Fructose der Analyt.
Erhalten Sie eine Menge der Analytchemikalie von geeigneter Reinheit. Normalerweise sollte die Reinheit über 99% liegen und der Analyt sollte von einem seriösen Chemieunternehmen bezogen werden. Im Fall von Fructose würden Sie beispielsweise reine Fructose von einem Chemielieferanten und nicht von einem Lebensmittelgeschäft kaufen.
Bestimmen Sie die maximal und minimal zu erwartenden Konzentrationen des Analyten in den Proben, die Sie mit der HPLC testen möchten. Bei Erfrischungsgetränken überprüfen Sie die Etiketten der Getränke und bestimmen den niedrigsten und höchsten Fructosegehalt unter den zu testenden Getränken. Denken Sie daran, dass die Ausgangsprobe (das Erfrischungsgetränk) während der Vorbereitung der Analyse (abhängig von der verwendeten HPLC-Methode) verdünnt oder auf andere Weise manipuliert werden kann, sodass die Analytkonzentration in den tatsächlich in die HPLC injizierten Proben möglicherweise geändert wird. Es ist die Analytkonzentration in den Proben, die auf der HPLC ausgeführt wird, die berücksichtigt werden muss.
Bestimmen Sie das Lösungsmittel, in dem Sie Ihren Analyten auflösen, um Kalibrierungsstandards zu erstellen. Dieses Lösungsmittel muss in der Lage sein, den Analyten über einen relativ weiten Konzentrationsbereich (mindestens so hoch wie in den zu testenden Proben) ordnungsgemäß aufzulösen. Dieses Lösungsmittel sollte im Idealfall auch der "mobilen Phase" sehr ähnlich sein: dem Lösungsmittel, das verwendet wird, um Proben durch das HPLC-Instrument zu transportieren.
Berechnen Sie die Menge des Analyten, die erforderlich ist, um eine "Stammstandard" -Lösung des Analyten herzustellen. Dies ergibt sich durch Multiplikation der erforderlichen Konzentration des Stammstandards mit dem gewünschten Volumen. Die Konzentration des Analyten in dieser Lösung sollte mindestens 10% höher sein als die höchste erwartete Probenkonzentration. Wenn die höchste zu erwartende Fructosekonzentration in einer Erfrischungsgetränkprobe 8 g / 100 ml beträgt, kann der Standard auf eine Konzentration von 10 g Fructose / 100 ml eingestellt werden. Ein vernünftiges Volumen beträgt 500 ml, daher wären 8/100 ml × 500 ml = 40 g Fructose erforderlich.
Wiegen Sie die erforderliche Menge an Analyt auf ein geeignetes Maß an Präzision ab. Oft ist ein auf eine oder zwei Dezimalstellen präziser Gewichtswert in Gramm geeignet, bei einigen Methoden kann jedoch eine höhere Genauigkeit erforderlich sein.
Übertragen Sie den abgewogenen Analyten in einen Messkolben mit dem erforderlichen Volumen und fügen Sie das gewünschte Lösungsmittel zur Füllmarkierung auf dem Kolben hinzu. Die Verwendung eines Messkolbens (z. B. anstelle eines Messbechers) erhöht die Genauigkeit des Standardkonzentrationswerts. Stellen Sie sicher, dass der gesamte Analyt in den Kolben überführt wird. Verwenden Sie gegebenenfalls etwas Lösungsmittel, um es einzuspülen.
Verschließen Sie den Messkolben und schütteln oder drehen Sie ihn vorsichtig, bis sich der Analyt vollständig aufgelöst hat.
Nehmen Sie eine Reihe von unterschiedlichen Verdünnungen des Stammstandards vor, indem Sie bekannte Volumina des Stammstandards in Messkolben überführen, Pipetten für eine genaue Übertragung verwenden und dann Lösungsmittel hinzufügen. Die niedrigste Standardkonzentration sollte unter der niedrigsten erwarteten zu analysierenden Probe liegen. Wenn im Beispiel für Erfrischungsgetränke die niedrigste erwartete Fructosekonzentration in einer Probe 2 g / 100 ml beträgt, könnte ein 1 g / 100 ml-Standard hergestellt werden. Dies würde durch eine zehnfache Verdünnung des Aktienstandards erreicht. Die Standardserie sollte insgesamt 5 oder 6 Konzentrationen enthalten, daher wären zusätzliche Verdünnungen zur Herstellung von Standards von vielleicht 3, 5 und 8 Gramm Fructose / ml erforderlich. Sie haben jetzt eine Reihe von Standardlösungen, mit denen Sie die HPLC kalibrieren können.