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Die Gram-Färbung ist ein differenzielles Färbeverfahren, das auf der Grundlage der Färbefarbe anzeigt, welche Bakterien grampositiv oder gramnegativ sind. Acetonalkohol ist ein Reagenz, das in diesem Verfahren verwendet wird, um die Farbdifferenzierung bereitzustellen. Grampositive Bakterien haben eine dicke Peptidoglycanschicht und färben sich lila, während gramnegative Mikroorganismen eine geringe bis keine Peptidoglycanschicht aufweisen und sich rosa färben.
Primäres Malfarben-Kristallviolett
Sobald ein Objektträger der Bakterienprobe hergestellt ist, wird Kristallviolett verwendet, um die Probe zuerst zu färben. Zu diesem Zeitpunkt erscheinen sowohl grampositive als auch gramnegative Bakterien lila. Normalerweise wird das Kristallviolett 30 Sekunden lang auf den Objektträger aufgetragen, bevor überschüssige Flecken mit Wasser abgewaschen werden. Das Kristallviolett kann ein wenig an den Peptidoglycanschichten haften, so dass nicht der gesamte Primärfleck mit dem Wasser abgewaschen wird.
Beizmittel-Jod
Anschließend wird der Probe eine Minute lang Jod zugesetzt. Es wirkt als Beizmittel, das dazu dient, Farbstoffe in einem Färbevorgang zu fixieren. Jod übernimmt diese Funktion, indem es sich an das Kristallviolett bindet und einen unlöslichen Komplex bildet, der viel besser an der dicken Peptidoglycanschicht in grampositiven Bakterienzellen haftet als nur das Kristallviolett allein. Nach Zugabe des Jods erfolgt kein Waschschritt mit Wasser.
Entfärber-Alkohol
Als Entfärbungsmittel kann entweder Aceton oder Ethylalkohol verwendet werden. Der Alkohol löst die in der äußeren Zellmembran von gramnegativen Bakterien vorhandenen Lipide auf und lässt den Kristallviolett-Jod-Komplex aus der dünneren Peptidoglycanschicht austreten. Der Alkohol wird 10 bis 20 Sekunden lang zugegeben; es wird auf den Objektträger gegossen, bis alles Jod weggewaschen ist und der Ablauf farblos ist. Zu diesem Zeitpunkt im Gram-Färbeprozess sind gramnegative Bakterien farblos, während grampositive Bakterien immer noch das Kristallviolett behalten. Sobald der Objektträger fertig ist, muss er mit Wasser abgespült werden, um den Entfärbungseffekt zu stoppen.
Gegenfärbung-Safranin
Safranin wird dann zugesetzt, um die Sichtbarkeit und den Kontrast gegenüber den farblosen gramnegativen Bakterien zu erhöhen. Der Fleck lässt diese Bakterien unter dem Mikroskop rosa erscheinen. Da der Farbstoff der gesamten Probe zugesetzt wird, färbt er auch grampositive Bakterien, aber je dunkler das Kristallviolett ist, desto heller ist die safraninrosa Farbe. Nachdem die Objektträgerprobe etwa eine Minute lang mit Safranin geflutet wurde, wird mit Wasser überschüssiger Fleck abgewaschen, der nicht an den Bakterienzellen haftete.