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Die Spektrophotometrie ist ein unschätzbares Werkzeug in der Chemie und Biologie. Die Grundidee ist einfach: Verschiedene Substanzen absorbieren Licht / elektromagnetische Strahlung bei einigen Wellenlängen besser als bei anderen. So sind zum Beispiel einige Materialien transparent, während andere farbig sind. Wenn Sie Licht einer bestimmten Wellenlänge durch eine Lösung strahlen, absorbiert sie umso mehr Licht, je höher ihre Konzentration ist. Um die Konzentration zu berechnen, müssen Sie Ihren Messwert mit den Messwerten für Standards mit bekannter Konzentration vergleichen. Das folgende Verfahren ist ein relativ allgemeines Verfahren, das unter Berücksichtigung eines Chemie-Lehrlabors erstellt wurde. Es kann jedoch auch für andere Einstellungen geändert werden.
Tragen Sie, wie immer bei der Arbeit im Labor, eine Schutzbrille, Handschuhe und einen langärmeligen Mantel, um Ihre eigene Sicherheit zu gewährleisten.
Drücken Sie den Gummiball zusammen, um die Luft zu entleeren, und legen Sie ihn dann auf Ihre Messpipette. Lassen Sie den Ball sich entspannen, damit das Wasser in die Pipette gesaugt wird. Entfernen Sie als nächstes die Birne und bedecken Sie die Spitze der Pipette mit Ihrem Finger. Dadurch wird die Pipette versiegelt, so dass die Lösung nicht herausfließt, bis Ihr Finger entfernt wird. Heben Sie die Fingerkante leicht an, damit etwas Lösung aus der Pipette fließt, bis Sie das gewünschte Volumen erreicht haben. Üben Sie mit etwas Wasser und einem Becher, um ein Gefühl dafür zu bekommen, wie die Messpipette funktioniert. Der Link unter dem Abschnitt Ressourcen enthält einen Filmclip, der Ihnen zeigt, wie Sie eine Pipette verwenden, falls Sie noch nie zuvor mit einer Pipette gearbeitet haben.
Beschriften Sie 5 Reagenzgläser als Standard 1-5. Sie können sie mit Klebeband und Stift oder mit einem Trockenlöschmarker beschriften.
Wählen Sie fünf Konzentrationen für Ihre Standards. Sie möchten, dass die Standardkonzentrationen in etwa dem gleichen Abstand voneinander liegen - z. B. 0,1 molar, 0,2 molar, 0,3 molar usw. - und in etwa dem Bereich, den Sie für Ihr Unbekanntes erwarten. Verwenden Sie vorerst die folgenden fünf Konzentrationen, aber denken Sie daran, dass Sie diese ändern müssen, wenn Sie Ihr eigenes Experiment durchführen:
Standard 1: 0,1 molar Standard 2: 0,2 molar Standard 3: 0,3 molar Standard 4: 0,4 molar Standard 5: 0,5 molar
Nehmen Sie als nächstes die 1-molare Standardlösung und geben Sie die folgenden Mengen in die Reagenzgläser 1-5. Denken Sie daran, dass diese Mengen anhand der oben aufgeführten Konzentrationen berechnet werden. Sie müssen sie daher möglicherweise nach Bedarf ändern, wenn Sie Ihr eigenes Experiment durchführen.
Standard 1: 0,8 Milliliter Standard 2: 1,6 Milliliter Standard 3: 2,4 Milliliter Standard 4: 3,2 Milliliter Standard 5: 4 Milliliter
Spülen Sie die Messpipette aus und geben Sie die folgenden Mengen entionisiertes Wasser um:
Standard 1: 7,2 Milliliter Standard 2: 6,4 Milliliter Standard 3: 5,6 Milliliter Standard 4: 4,8 Milliliter Standard 5: 4,0 Milliliter
Grundsätzlich besteht die Idee darin, die Lösungsmenge in jedem Röhrchen auf 8 Milliliter zu bringen.
Verschließe jedes der Standardröhrchen mit Parafilm und kehre sie um, um sie zu mischen.
Markieren Sie weitere fünf Reagenzgläser als "Unbekannt 1-5". Fügen Sie jeweils die gleichen Mengen Ihrer unbekannten oder Testlösung hinzu, die Sie mit der 1-molaren Lösung für die Standards verwendet haben. Mit anderen Worten enthält Unbekannt 1 0,8 ml Testlösung und 7,2 ml Wasser, Unbekannt 2 1,6 ml Testlösung und 6,4 ml Wasser und so weiter.
Verschließe jedes der Unbekannten mit Parafilm und kehre es vorsichtig um, um es zu mischen.
Schalten Sie das Spektralphotometer ein und lassen Sie es aufwärmen. Die erforderliche Zeit hängt vom Modell und vom Hersteller ab.
Stellen Sie die Wellenlänge am Spektralphotometer ein. Die Wellenlänge hängt von der Art der Chemikalie in Ihrem Experiment ab. Nehmen Sie vorerst 500 nm an, obwohl Sie sich daran erinnern müssen, dass Sie dies für verschiedene Experimente ändern müssen.
Kalibrieren Sie Ihr Spektralphotometer. Das Kalibrierungsverfahren hängt vom verwendeten Gerät ab. Bei der Spectronic 20, einem in Lehrlabors üblichen Modell, stellen Sie das Gerät zunächst so ein, dass "0 Prozent T" angezeigt wird, wenn keine Küvette geladen ist, und stellen Sie es dann so ein, dass "100% T" angezeigt wird, wenn eine leere Küvette deionisiertes Material enthält Es wird nur Wasser geladen. Diese Verfahren können je nach Art des verwendeten Geräts variieren. Weitere Informationen finden Sie in den Anweisungen des Herstellers.
Nehmen Sie nach dem Kalibrieren des Geräts das Standard-1-Reagenzglas und gießen Sie den Inhalt in eine saubere Küvette, bis er die Fülllinie erreicht. Wischen Sie die Küvette mit einem Kimwipe ab, um Finger oder anderen Schmutz zu entfernen. Setzen Sie die Küvette in das Spektrophotometer ein und notieren Sie den Wert "% T".
Wiederholen Sie diesen Vorgang für alle 10 Proben. Achten Sie darauf, die Küvette zwischen den Proben zu reinigen, um sicherzustellen, dass Ihre Ergebnisse so genau wie möglich sind.
Nehmen Sie die Ergebnisse für Ihre Standards und geben Sie sie in ein Tabellenkalkulations- / Grafikprogramm wie Excel oder OpenOffice ein.
Dividieren Sie mithilfe des Tabellenkalkulationsprogramms 100 Prozent durch jeden der "% T" -Werte für die Standards und führen Sie dann das Protokoll des Ergebnisses durch. Diese Berechnung gibt Ihnen die Extinktion. Wenn Sie die Formel eingeben, übernimmt Ihr Tabellenkalkulationsprogramm die Berechnung für Sie.
Beispiel: Wenn% T 50,6 ist, lautet die Formel, die Sie in das Tabellenkalkulationsprogramm eingeben, wie folgt:
log (100 / 50.6)
Das Tabellenkalkulationsprogramm führt die Arithmetik aus.
Machen Sie dasselbe für alle fünf unbekannten / experimentellen Werte.
Zeichnen Sie die Extinktionswerte für alle fünf Standards mit der Konzentration auf der x-Achse und der Extinktion auf der y-Achse auf. Passen Sie mit dem Tabellenkalkulationsprogramm eine lineare Gleichung an dieses Diagramm an. Die Gleichung hat die Form y = mx + b. Die meisten Tabellenkalkulationsprogramme verfügen über eine lineare Regressionsfunktion. Weitere Informationen zur Verwendung der linearen Regressionsfunktion finden Sie im Benutzerhandbuch Ihres Tabellenkalkulationsprogramms.
Nehmen Sie die Gleichung für die am besten passende Linie aus Ihrem Tabellenkalkulationsprogramm und lösen Sie sie für y, indem Sie b von beiden Seiten subtrahieren und beide Seiten durch m dividieren. Das Ergebnis sieht folgendermaßen aus:
(y - b) / m = x
Wobei b und m Werte sind, die von Ihrem Tabellenkalkulationsprogramm gefunden wurden.
Überprüfen Sie Ihre Extinktionswerte auf Unbekanntes und wählen Sie drei Werte aus, die in etwa im gleichen Bereich liegen wie die Standards. Verwenden Sie diese drei Extinktionswerte für Ihre verbleibenden Berechnungen. Wenn alle fünf in den gleichen Bereich fallen wie die Standards, können Sie stattdessen alle fünf verwenden, aber Sie müssen mindestens drei verwenden.
Stecken Sie jeden der drei Extinktionswerte anstelle von y in Ihre Gleichung. Denken Sie daran, dass Ihre Gleichung die folgende Form hatte:
(y - b) / m = x
Sie möchten also den Extinktionswert für jedes Unbekannte anstelle von y in die Gleichung einfügen und dann x berechnen. Mit dem Tabellenkalkulationsprogramm können Sie diese Berechnung für Sie durchführen und beschleunigen. Sie haben jetzt die Konzentration der interessierenden Chemikalie in drei Ihrer verdünnten Unbekannten berechnet. Die ursprüngliche Lösung wurde jedoch verdünnt, um diese Unbekannten herzustellen. Sie müssen nun rückwärts arbeiten und die Konzentration der ursprünglichen Lösung anhand des Verdünnungsfaktors berechnen.
Jede unbekannte Probe, die Sie in das Spektrophotometer eingeführt haben, wurde mit einer anderen Menge verdünnt. Infolgedessen sollten Sie jetzt die berechnete Konzentration basierend auf der Extinktion für jeden unbekannten Messwert wie folgt teilen:
Unbekannt 1: Teilen durch 0,1 Unbekannt 2: Teilen durch 0,2 Unbekannt 3: Teilen durch 0,3 Unbekannt 4: Teilen durch 0,4 Unbekannt 5: Teilen durch 0,5
Beachten Sie jedoch, dass diese Zahlen auf der Annahme beruhen, dass Sie die oben angegebenen Verdünnungen verwenden. Denken Sie daran, diese Werte zu ändern, wenn Sie Ihre Proben mit einer anderen Menge verdünnt haben.
Addieren Sie Ihre Ergebnisse und teilen Sie sie durch die Anzahl der Ergebnisse. Dies gibt Ihnen einen Durchschnitt. Geben Sie diese Zahl als Ergebnis für die Konzentration der ursprünglichen Lösung an.