Inhalt
DNA
Desoxyribonukleinsäure und Proteine. Die DNA ist in Einheiten unterteilt, die als Gene bezeichnet werden und jeweils für eine bestimmte RNA- oder Proteinsequenz kodieren. Gene werden untersucht, um die biologische Struktur und Funktion, Evolution, Krankheit und viele andere Aspekte lebender Systeme kennenzulernen. Um die Gene im Detail zu untersuchen, muss die DNA aus den interessierenden Zellen isoliert und gereinigt werden.
DNA-Extraktion
Obwohl DNA aus einer einzelnen Zelle extrahiert und untersucht werden kann, reicht es nicht aus, sie mit bloßem Auge zu sehen. Um eine ausreichende Menge für das Spoolen zu erhalten, gilt: Je mehr Zellen Sie bearbeiten müssen, desto besser (viele Millionen).
Genaue Protokolle variieren beträchtlich, um den einzigartigen Eigenschaften spezifischer Proben Rechnung zu tragen, aber die allgemeinen Schritte sind Homogenisierung, Lyse, Aufschluss, Trennung und Sammlung. Das Verfahren wird am besten in einem kleinen (je nach Größe der Probe) Glas- oder Kunststoffröhrchen durchgeführt.
Eine Probe wird im Allgemeinen gemischt oder gemahlen, um die Zellen gründlich voneinander zu trennen. Dies macht die Zellbestandteile für die folgenden Reagenzien leichter zugänglich. Dem Homogenisat werden dann Waschmittel oder Enzyme zugesetzt, um die Zellmembranen (und Kernmembranen, wenn die Zellen eukaryotisch sind) zu lysieren, um die DNA freizusetzen. Zu diesem Zeitpunkt ist die DNA von Proteinen, Lipiden und Kohlenhydraten umgeben - alles andere, was in den Zellen enthalten war.
Ein weiterer enzymatischer Aufschluss kann erforderlich sein, um Proteine abzubauen, damit sie nicht an DNA binden und deren Sammlung stören. Die DNA wird durch Zugabe von kaltem, reinem Ethyl- oder Isopropylalkohol vom restlichen Zellinhalt getrennt. DNA ist in diesen Alkoholen nicht löslich, daher kondensiert sie, um den Kontakt mit dem Alkohol so gering wie möglich zu halten. Die kondensierte DNA wird dann üblicherweise durch Zentrifugation - oder Spulen - gesammelt.
DNA-Spooling
Die DNA-Sammlung durch Aufwickeln ist wirksam, wenn eine große Menge DNA aus einem Extraktionsverfahren erhalten wird. Es ist auch eine ausgezeichnete Demonstrationsmethode, da ein beeindruckendes Gewirr reiner DNA deutlich sichtbar ist.
Um DNA aufzuspulen, muss der Trennungsschritt sorgfältig durchgeführt werden. Wenn es nicht Teil der zuvor zugesetzten Lysereagenzmischung war, muss vor dem Alkoholzugabeschritt eine konzentrierte Salzlösung (Natriumchlorid) zu der Lösung gegeben werden. Der kalte Alkohol wird langsam über die Seite des Reagenzglases gegossen, um eine Schicht auf der wässrigen Lösung zu bilden, wobei ein Vermischen vermieden wird. Wenn es richtig gemacht wird, bildet der Alkohol eine eigene Schicht auf der Salzschicht. Dann kommt das Spulen.
Um die DNA aus der Salzschicht zu sammeln, setzen Sie vorsichtig einen Glasrührstab durch die Alkoholschicht, bis er den Boden des Röhrchens berührt. Drehen Sie den Stab langsam zwischen den Fingern, während Sie die Grenzfläche zwischen den beiden Schichten beobachten. Wenn genug DNA vorhanden ist, klumpt es an der Grenzfläche zwischen den Schichten zusammen, um eine milchig durchscheinende Masse zu bilden. Drehen Sie den Stab, um die DNA (das ist der Spulenteil) darum zu wickeln, und ziehen Sie ihn aus dem Röhrchen heraus. Die DNA kann zur Lagerung oder weiteren Analyse in ein anderes Röhrchen mit reinem Alkohol überführt werden.