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Die Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC) ist eine Labortechnik zur Trennung und Identifizierung von Verbindungen. Es ist eine Art Säulenchromatographie, die auf unterschiedlichen Polaritäten von Verbindungen in einer Lösung beruht, um sie zu trennen. Die HPLC unterscheidet sich von der Standard-Säulenchromatographie dadurch, dass mit Druck die Lösung schneller durch die Säule gedrückt wird und daher schnellere und manchmal genauere Ergebnisse erzielt werden. Das Ziel ist es, Verbindungen in der Spalte zu trennen und sie getrennt austreten zu lassen.
Koelution
Aufgrund der HPLC-Geschwindigkeit und der Abhängigkeit von unterschiedlichen Polaritäten der Verbindungen können zwei Verbindungen mit ähnlicher Struktur und Polarität gleichzeitig oder nahezu gleichzeitig aus der Chromatographievorrichtung austreten. Dies wird als Koelution bezeichnet. Die Koelution macht es schwierig, genau zu bestimmen, welcher Teil der Mischung zu welchem Zeitpunkt eluierte.
Adsorbierte Verbindungen
Die HPLC verwendet typischerweise eine Glassäule, die mit Perlen aus verschiedenen Materialien gefüllt ist. Die Gemische, die durch die Säule gedrückt werden, weisen Chemikalien auf, die mit unterschiedlichen Stärken an die Kügelchen binden. Die Stärke der Bindung, die von der Ähnlichkeit der Polarität abhängt, bestimmt, wie lange die Chemikalie an die Perle bindet, bevor sie freigesetzt wird. Einige Verbindungen binden so stark, dass sie im Wesentlichen nie aus den Kügelchen in der Säule freigesetzt werden und nie in der die Säule verlassenden Lösung gemessen werden.
Kosten
Typische Labortrennverfahren umfassen die Entwicklung eines Assays oder eines Trennverfahrens und die anschließende Durchführung dieses Assays, um einzelne Verbindungen von einer Lösung zu trennen. Dies führt jedoch in der Regel zu mehreren Lösungen, die ebenfalls Verfahren unterzogen werden müssen, was zu einer exponentiellen Zunahme der Komplexität führt. Obwohl HPLC diesen Prozess oft vereinfachen und beschleunigen kann, können die Kosten für die Entwicklung einer HPLC-Vorrichtung enorm werden. Die Entwicklung einer HPLC-Apparatur ist zwar viel effizienter, jedoch viel kostenintensiver als die Entwicklung anderer Assays zur Trennung von Verbindungen. Dies macht es für viele kleine private Laboratorien nicht rentabel.
Komplexität
HPLC dient nicht nur zur Trennung einfacher Verbindungen, sondern auch zur Isolierung spezifischer Proteine aus einem Zellgemisch. In diesem Fall sind die Perlen in der Säule normalerweise mit einem Antikörper beschichtet, der für das zu sammelnde Protein spezifisch ist. Die Proteine binden die Antikörper und die verbleibende Lösung wird durch die Säule geleitet, dann werden die Proteine unter Verwendung einer anderen Lösung freigesetzt und gesammelt. Dies erfordert einen hochqualifizierten Techniker, der die Säule jederzeit überwacht und sicherstellt, dass der Prozess genau wie geplant abläuft.